Μελέτη RANKL-επαγόμενων παθογενετικών μηχανισμών σε γενετικά ζωικά πρότυπα και νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις

2014

Abstract

Η οστική ανακατασκευή είναι μια συνεχής διαδικασία ανανέωσης των μικρομονάδωντων οστών με διαδοχική ενεργοποίηση και λειτουργία των οστεοκλαστών καιοστεοβλαστών, κυττάρων υπεύθυνων για την οστική απορρόφηση και παραγωγή,αντίστοιχα. Φυσιολογικά και οι δύο διεργασίες βρίσκονται σε δυναμική ισορροπίαμεταξύ τους, εξασφαλίζοντας την σκελετική ακεραιότητα. Η διατάραξη αυτής τηςισορροπίας αποτελεί την κύρια αιτία πρόκλησης σκελετικών νοσημάτων, όπως ηοστεοπόρωση. Η κυτταροκίνη RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κΒLigand) μέλος της υπεροικογένειας του TNF (Tumor Necrosis Factor), αποτελεί τονκύριο διαμεσολαβητή στην διαδικασία της οστικής απορρόφησης καθώς επάγει τηνδιαφοροποίηση, επιβίωση και ενεργοποίηση των οστεοκλαστών. Ως τριμερέςσυνδέεται στον υποδοχέα του RANK, επάγοντας τον τριμερισμό του και τηνενεργοποίηση των ενδοκυτταρικών μονοπατιών που οδηγούν στην δημιουργίαώριμων και λειτουργικών οστεοκλαστών, ενώ η δράση του RANKL αναστέλλεταιαπό την οστεοπροτεγερίνη (OPG), ένα ανταγωνιστικό διαλυτό υποδοχέα. Η αναλογίαμεταξύ RANKL και OPG καθορίζει τη βιοδιαθεσιμότητα και τη δράση του RANKLστα βιολογικά συστήματα. Η σημασία του RANKL στην βιολογία του σκελετικούσυστήματος φαίνεται από το γεγονός ότι μεταλλάξεις στο γονίδιο του RANKL προκαλούν αυτοσωμική υπολειπόμενη οστεοπέτρωση λόγω αδυναμίας σχηματισμούοστεοκλαστών. Αντιθέτως, αυξημένη παραγωγή του RANKL συνδέεται με επαγωγήοστεοκλαστικής δραστηριότητας και οστικής απώλειας σε ασθένειες όπως ηοστεοπόρωση, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, το πολλαπλό μυέλωμα, οι οστικέςμεταστάσεις και οι περιοδοντικές ασθένειες. Η αναστολή της δράσης του RANKLθεωρείται μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για την παρεμπόδιση τηςοστικής απώλειας στις παραπάνω ασθένειες και έχει ήδη εγκριθεί η χορήγηση ενόςμονοκλωνικού αντισώματος, του denosumab, έναντι του RANKL σεεμμηνοπαυσιακές οστεοπορωτικές γυναίκες. Το γεγονός αυτό καθιστά αναγκαία τηνεύρεση νέων αναστολέων του RANKL και την αξιολόγησή τους σε κατάλληλα ζωικάμοντέλα.Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν δύο μοναδικά ζωικάμοντέλα που έχουν δημιουργηθεί από την ερευνητική ομάδα της Επίκ. ΚαθηγήτριαςΕλένης Ντούνη. Το πρώτο γενετικό μοντέλο χαρακτηρίζεται από αυτοσωμικήυπολειπόμενη οστεοπέτρωση και οφείλεται σε μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιοRANKL του ποντικού που προκαλεί αντικατάσταση ενός αμινοξέος από γλυκίνη σε αργινίνη στην θέση 278, (G278R), καθιστώντας ανενεργή την πρωτεΐνη RANKL. Η μελέτη της υπεύθυνης μετάλλαξης έχει οδηγήσει στην κατανόηση του μοριακούπαθογενετικού μηχανισμού και στον σχεδιασμό νέων αναστολέων έναντι τουRANKL. Πιο συγκεκριμένα δείξαμε με πειράματα ανοσοαποτύπωσης και crosslinkingότι η μεταλλαγμένη RANKLG278R πρωτεΐνη δεν σχηματίζει ομοτριμερή καιέχει απολέσει την βιολογική της δραστικότητα. Ακόμη σε ex vivo κυτταρικές δοκιμέςδείξαμε ότι η RANKLG278R δεν επάγει τον σχηματισμό οστεοκλαστών ενώ ασκείκυρίαρχη αρνητική επίδραση στην δράση της άγριου τύπου RANKL. Λ όγω τ ηςυψηλής συντηρητικότητας που εμφανίζει η γλυκίνη στην θέση 278 μεταξύ των μελώντης υπεροικογένειας του TNF, προχωρήσαμε σε βιοχημικό και λειτουργικόχαρακτηρισμό των πρωτεϊνών TNF και BAFF του ανθρώπου εισάγοντας τηναντίστοιχη αμινοξική αλλαγή από γλυκίνη σε αργινίνη. Ομοίως, δείξαμε ότι οιμεταλλαγμένες TNFG122R και BAFFG249R πρωτεΐνες δεν σχηματίζουν τριμερή και δενείναι βιολογικά ενεργές. Η αναγνώριση ενός τόσο κρίσιμου αμινοξέος πουσυμμετέχει ενεργά στον τριμερισμό των πρωτεϊνών της TNF υπεροικογένειαςαποτελεί δυνητικά ένα σημαντικό φαρμακευτικό στόχο στην λογική σχεδιασμού νέωνφαρμάκων για την αναστολή του τριμερισμού. Το μικρό μόριο SPD-304 έχει χαρακτηριστεί ως ένας αναστολέας του τριμερισμού του TNF ωστόσο ηδραστικότητά του έναντι του RANKL δεν ήταν γνωστή. Δείξαμε ότι το SPD-304αλληλεπιδρά με την RANKL πρωτεΐνη προκαλώντας αναστολή σε δοκιμέςοστεοκλαστογένεσης. Όμως η υψηλή τοξικότητα του SPD-304 το καθιστάακατάλληλο για φαρμακευτική χρήση. Έτσι, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν συνολικά72 ενώσεις ανάλογα του SPD-304 από τις οποίες ταυτοποιήσαμε 7 ενώσεις με τα εξήςχαρακτηριστικά: 1) αποτελούν ισχυροί αναστολείς σε δοκιμές οστεοκλαστογένεσης,2) παρουσιάζουν σημαντικά μικρότερη κυτταροτοξικότητα σε σχέση με το SPD304,και 3) παρουσιάζουν μεγάλη εξειδίκευση με την πρωτεΐνη-στόχο RANKL. Επίσης,βιοχημικός έλεγχος έδειξε ότι τα SPD-304 ανάλογα αποδιατάσσουν το τριμερές τουRANKL. Επόμενος στόχος είναι η αξιολόγηση αυτών των αναστολέων του RANKLσε προκλινικό επίπεδο με τη χρήση κατάλληλων ζωικών μοντέλων οστεοπόρωσης.Πάνω σε αυτή την λογική, προχωρήσαμε στην δημιουργία και χαρακτηρισμό ενόςκαινοτόμου γενετικού μοντέλου οστεοπόρωσης με την υπερέκφραση του RANKLτου ανθρώπου σε διαγονιδιακά ποντίκια. Χαρακτηρίσαμε 2 διαγονιδιακές σειρές, την Tg5516 που φέρει ένα αντίγραφο του διαγονίδιου και την Tg5519 με δέκα επιπλέοναντίγραφα. Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του διαγονιδίου huRANKLέδειξε έκφραση στην Tg5516 σειρά και ακόμη υψηλότερα επίπεδα στην Tg5519σειρά κυρίως σε οστά, σπλήνα και εγκέφαλο. Επίσης, η υπερέκφραση του huRANKL στις δύο διαγονιδιακές σειρές ακολουθεί το ίδιο πρότυπο έκφρασης με το ενδογενέςγονίδιο (muRANKL). Ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός έδειξε ότι η Tg5516 σειράαποτελεί ένα μοντέλο ήπιας οστεοπόρωσης με οστική απώλεια του σπογγώδουςοστού, ενώ η Tg5519 σειρά εμφανίζει έντονη οστεοπόρωση με κύρια χαρακτηριστικάτην πλήρη απώλεια του σπογγώδους οστού, πορώδη δομή στο φλοιώδες οστό,αυξημένη οστεοκλαστογένεση, σταδιακή καταστροφή της αυξητικής πλάκας καιαυξημένη λιπογένεση στο μυελό των οστών. Τέλος, με την θεραπεία τηςοστεοπόρωσης στα Tg5519 ποντίκια έπειτα από χορήγηση του αντισώματοςdenosumab, διαπιστώσαμε ότι τα TgRANKL ποντίκια αποτελούν κατάλληλα μοντέλαοστεοπόρωσης για την αξιολόγηση νέων φαρμάκων, όπως των SPD-304 αναλόγων,σε προκλινικό επίπεδο.

Abstract

Related Papers