Rekombinante Expression und Identifizierung essentieller Strukturelemente des humanen H+-Aminosäure-Cotransporters hPAT1
Abstract
Der H+/Aminosäure-Cotransporter hPAT1 wird überwiegend in der apikalen Membran von Darmepithelzellen exprimiert und ist neben anderen Transportsystemen für die Absorption von Aminosäuren nach luminalem Proteinverdau verantwortlich. Neben den physiologischen Substraten werden auch pharmazeutisch relevante Wirkstoffe mit ähnlicher Grundstruktur von hPAT1 akzeptiert, wodurch die orale Gabe GABA-verwandter Wirkstoffe sowie anderer drugs und prodrugs ermöglicht wird. Um das Membranprotein rekombinant, in für die Strukturaufklärung ausreichenden Mengen herzustellen, wurde das E. coli-Expressionssystem und ein zellfreies Expressionssystem, basierend auf einem E. coli-Lysat, verwendet. Weiterhin wurde über zielgerichtete Mutagenesestudien die Funktion der extrazellulär gelegenen Cysteinreste und Glykosylierungsstellen untersucht. Nach heterologer Expression und Charakterisierung der generierten Mutanten in HRPE-Zellen und Xenopus laevis Oozyten konnte eine essentielle Disulfidbrücke zwischen Cys180 und Cys329 in hPAT1 identifiziert werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Transporter in vivo an den Asparaginresten N174, N183 und N470 glykosyliert wird.